books modify the immune response

تعديل السايتوكينات

لكي يكون اللقاح فعالا يجب أن ينتج استجابة مناعية مناسبة لمسبب مرض محدد وقدرة لقاح الدنا على بلمرة الخلايا التائية المساعدة تجاه سجل TH1 أو TH2 وإنتاج CTL و/أو جسم مضاد عند اللزوم مما يشكل فائدة عظمى في هذا الصدد. يمكن تحقيق ذلك عن طريق تعديل نموذج مولد الضد المعبَّر عنه (مثال: خلوي مقابل مفرز) وطريقة ومسار التوصيل وجرعة الدنـا التي تم إيصالها.

على أية حال، فيمكن تحقيق ذلك عن طريق مشاركة الإشراف على الدنا البلازميدي الذي يشفّر جزيئات المناعة التنظيمية مثل السايتكونات والليمفونيكات أو الجزيئات المساعدة للتنبيه. يمكن إدارة هذه "المواد الجينية المساعدة" بعدة طرق:

• كخليط من بلازميدين منفصلين، أحدهما يشفّر الـمستمنع فيما الآخر يشفّر السايتوكين.
• كناقل وحيد ثنائي أو متعدد السيسترونات مفصول بمناطق فاصلة أو
• ككمير مشفر البلازما أو بروتين التحام.

عموما فإن العوامل الالتهابية المساعدة للإشراف (مثل الإنترلوكينات وعامل النخر الورمي ومحفزات إعمار الخلايا المحببة والملتهمة (GM-CSF)(بالإضافة إلى الايتوكينات المنتجة لخلايا TH2 ترفع من استجابات مضادات الأجسام فيما تقوم العوامل الالتهابية والسايتوكينات المنتجة لخلايا TH1 بخفض الاستجابة الخلطية وزيادة استجابات السايتوكينات (وهي الأكثر أهمية في حالة الحماية من الفيروسات على سبيل المثال). تستخدم الجزيئات المساعدة للتنبيه مثل B7-1 و B7-2 و CD40L في بعض الأحيان أيضا.

تم تطبيق هذا المبدأ بنجاح في الإدارة الموضوعية لترميز لدنا البلازميدي IL-10. البلازميد المشفر B7-1 (دواء على APCs) حسّن بنجاح الاستجابة المناعية في نماذج مضادات الورم ومزج البلازميدات المشفرة لـ GM-CSF وبروتينات غلاف الحيوان البوغي لـ P.

قام yoelii (PyCSP) بتحسين الحماية ضد التحديات المتعاقبة (في حين فشل PyCSP المشفر بلازميديا في ذلك). اقترح أنه ربما يتسبب GM-CSF في تقديم الخلايا التغصنية للمستضد بشكل أكثر فعالية ويحسن من إنتاج IL-2 وتفعيل خلية TH مما يؤدي بالتالي إلى تحريك الاستجابة المناعية المتزايدة. يمكن تحسين هذا أكثر بواسطة العامل الأولي باستخدام مزيج من pPyCSP و pGM-CSFوالحقن لاحقا بفيروسات جدرية مطعمة تعبر عن PyCSP. على أي حال فالمشاركة بحقن البلازميدات التي ترمز GM-CSF (أو IFN-γ أو IL-2) والتحام البروتين من P. بروتين سطح الميروزويت شابودي رقم 1 (النهاية الكربونية) وسطح فيروس بروتين التهاب الكبد ب (PcMSP1-HBs) يلغي فعليا الحماية ضد التحدي مقارنة بالحماية المكتسبة عن طريق إيصال pPcMSP1-HBs لوحدهـا.

فوائد استخدام المواد المساعدة هي كلفتها المنخفضة وبساطة إدارتها وتجنب السايتكوينات المطعمة غير المستقرة والتي يحتمل أن تكون سامة، العوامل المساعدة "الاصطلاحيّة" (مثل الشب وفوسفات الكالسيوم والدهن أحادي الفسفور A وتوكسين الكوليرا والحويصلات الكاثودية (الموجبة) وحويصلات مان-المغلّفة و QS21 وكاربوكسي مثيل سللوز الكالسيوم (carboxymethylcellulose) وأوبينيميكس(ubenimix)). ومع ذلك فإن السميّة المحتملة لتعبير السايتوكين الممتد لم يتم تأكيدها في أنواع حيوانية عديدة ومهمة تجاريا فما زالت الجينات السايتوكينية بحاجة إلى أن يتم تعريفها وعزلها. إضافة إلى ذلك، فإن السايتوكنات المشفرة البلازميد المتعددة تعدل نظام المناعة بطرق مختلفة تبعا لوقت الإيصال. مثلا، بعض سايتكونات الدنا البلازميدي يتم إيصالها على النحو الأمثل بعد توليد مستمنع الدنا البلازميدي وذلك لأن الإيصال السابق أو مشاركة الإيصال من الممكن فعليا أن تخفض من استجابة معينة وتزيد من استجابات غير محددة.

لَبِنات CpG لتنشيط المناعة

يبدو أن الدنا البلازميدي بحد ذاته له تأثير مساعد على نظام المناعة؛ حيث وجد أن الدنا المشتق على نحو بكتيري يحرك آليات الدفاع المناعي وتنشيط الخلايا التغصنية وإنتاج سايتوكينات خلايا TH1. ويحدث هذا بسبب ملاحظة سلاسل ثنائي النوكليوتيد CpG معينة والتي تحفز المناعة.

تتكرر متواليات CpG التنشيطية (تعرف بـ CpG-S) أكثر بعشرين مرة في الدنا المشتق على نحو بكتيري من حقيقيات النواة. وذلك لأن حقيقات النواة تعرض "إخماد CpG"-مثال: أزواج ثنائي النوكليوتيد تحدث أقل بكثير من المتوقع. زيادة على ذلك، فإن سلاسل CpG-S هي تحت مثـْيَلة hypomethylated . عادة ما يحدث هذا في الدنا البكتيري بينما لبناتCpG التي تحدث في حقيقيات النواة هي مميثلة جميعها في نيوكليوتيدات السيتوزين. على العكس من ذلك، سلاسل النيوكليوتيدات التي تمنع تنشيط الاستجابة المناعية (تدعى بالـ CpGالمعادلة أو CpG-N) يتم تمثيلها أكثر في الجينومات حقيقية النواة. وجد أن سلسلة تحفيز المناعة المثالية هي عبارة عن ثنائي نوكليوتيد CpG غير مميثلة محاطة ب اثنين من بيورينات 5’ واثنين من البيرميدينات رقم 3’. كما أن المناطق المرافقة خارج سداسي تحفيز المناعة هذا ليكون غنيا بالجوانين لتأكيد الربط والامتصاص في الخلايا الهدف.

يعمل النظام الفطري بالتآزر مع النظام المناعي المساعد لجبل استجابة ضد بروتين الدنا المشفر. تنتج سلاسل CpG-S تنشيطا لخلايا (ب) متعددة النسيلة وتنظيم تعبير السايتوكونات وإفرازها. تفرز الخلايا الملتهمة المحفزة IL-12, IL-18, TNF-α, IFN-α, IFN- و IFN-γ بينما تفرز خلايا (ب) المحفزة IL-6 وبعض IL-12. يمكن أن يضمن التلاعب بسلاسل CpG-S وسلاسل CpG-N في العمود الفقري البلازميدي للقاح الدنا نجاح الاستجابة المناعية للمستضد المناعي ويقود الاستجابة المناعية تجاه النمط الظاهري لخلايا TH1. يصبح هذا مفيدا إذا احتاج مسبب المرض استجابة لخلايا TH بغرض الوقاية. استخدمت سلاسل CpG-S أيضا كمساعدات خارجية لكل من الدنا وتلقيح البروتين المطعم بمعدلات نجاح متفاوتة. كائنات حية أخرى بلبنات CpG ممـثـْيَلة أظهرت أيضا توسع تعبير خلايا ب متعددة النسيلة. على أي حال فإن الآلية وراء هذا قد تكون أكثر تعقيدا من مثـْيَلة -تحت مثـْيَلة لدنا الفئران لم يثبت جبلها لاستجابة مناعية.

معظم الأدلة على وجود سلاسل CpG المحفزة مناعيا تأتي من دراسات مسبب التيفوس الفأري. من الواضح أن استقراء هذه المعطيات على أنواع أخرى يجب أن يتم بحذر فالأنواع المختلفة قد يلزمها سلاسل مرافقة أخرى كالربط مع خصوصيات مستقبلات الخلايا الزبالة التي تختلف من نوع لآخر. زيادة إلى ذلك فأنواع مثل الحيوانات المجترة قد تكون غير حساسة لسلاسل التحفيز المناعي تبعا لعبء الجهاز الهضمي الكبير الذي تبديه. قد تكون مزيد من الدراسات مفيدة في تحسين تلقيح الدنا خصوصا في صناعة أغذية الحيوانات.

الدعائم البديلة

يمكن تعزيز الاستجابة المناعية للدنا المرأس عن طريق الإشراف على البروتين المطعم أو فيروسات الجدري المطعّمة. استراتيجيات "تعزيز-الرئيس" مع البروتين المطعم نجحت بزيادة كل من معادلة الجسم المضاد (titre) وجشع الجسم المضاد وثباته للمستمنعات الضعيفة مثل البروتين المغلف لفيروس HIV-1. تم إثبات أن زيادات الفيروس المطعم فعالة جدا في تعزيز استجابات خلايا CTL للدنا المرأس. يركز الترأيس باستخدام الدنا الاستجابة المناعية على المستمنع المطلوب، بينما التعزيز بالفيروس المطعم يعطي كمية أكبر من المستضد المعبر عنه مما يؤدي لزيادة كبيرة في استجابات مخصوصة لخلايا CTL.

استراتيجيات تنشيط الترأس كانت ناجحة في إنتاج الوقاية ضد تحدي الملاريا في عدد من الدراسات. الفئران المرأسة التي تحوي دنا بلازميديا يشفر سطح غلاف البروتين الحيوان البوغي المتصورة (بلازميدية) لـ yoelii(PyCSP), ومن ثم تنشط بلقاح فيروسي مطعم يعبر عن نفس البروتين ويحوي مستويات أعلى من الجسم المضاد بصورة ملحوظة. نشاط الـ CTL و IFN-γ ومن ثم مستويات أعلى من الحماية من تلك التي تم تحصينها وتنشيطها عن طريق الدنا البلازميدي وحده. يمكن تحسين ذلك أكثر عن طريق الترأس بخليط من البلازميدات المشفرة PyCSP والتيفوس الفأري قبل التنشيط بفيروس اللقاح المطعم. تم إثبات استراتيجية تنشيط ترأس فعالة لنموذج P. knowlesi للملاريا القردية. تم رأس قرود الربص بلقاح دنا متعدد المركبات والمستويات يرمّز مستضدات مرحلة الكبد الثانية وبروتين سطح غلاف الحيوان البوغي (PkCSP) وبروتين سطح الحيوان البوغي رقم 2 (PkSSP2) واثنين من مستضدات مرحلة الدم وبروتين سطح المتصوّرة القميّة رقم 1 (PkMSP1p42). تم تعزيزها فيما بعد بفيروس جدري الكناريا المطعم مرمزا كل المستضدات الأربعة (ALVAC-4. طورت القرود المطعمّة مستضدات ضد الحيوانات البوغية والكريات الحمراء المصابة واستجابة الخلايا التائية المفرزة من نوع IFN-γ ضد بيبتيدات من PkCSP. تم تحقيق الحماية الجزئية ضد اختبار الحيوان البوغي وتم تقليل متوسط التسمم الدموي الطفيلي بشكل ملحوظ مقارنة بالتحكم بالقرود. بينما لا تكون هذه النماذج مثالية في حالة استقراء البلازميد المنجلي في حالة الإنسان إلا أنها مهمة في الاختبارات ما قبل السريرية.

طرق إضافية لتحسين استجابات الدنـا المناعية

تركيبات من الحمض النووي

يمكن تحسين فعالية مناعة الدنا عن طريق تثبيت الدنا ضد التحلل الحيوي وزيادة فعالية إيصال الدنا إلى خلايا تقديم المُسْتَضَد. تم إثبات هذا عن طريق تغليف الحويصلات الكاثودية القابلة للتحلل (مثل متعدد (lactide-co-glycolide) موضوعة مع بروميد سيتيل ثلاثي ميثيل الأمونيوم بالإنجليزية cetyltrimethylammonium bromide) مع الدنا. مثل حويصلات الدنا المغلفة هذه يمكن أن تكون فاعلة في رفع استجابة CTL كفيروسات الوقس المطعمة خصوصا عند خلطها مع الشّب؛ ويبدو أن الجسيمات التي يبلغ قطرها 300 نانو مترا هي الأكثر فعاليّة للامتصاص بواسطة الخلايا العارضة (المقدِّمة) للمُسْتَضَد.

نواقل الفيروسات الألفاويّة

استخدمت نواقل الناشئة عن فيروسات ألفا المعاد صياغتها وراثيا لتحسين فعالية تلقيح الدنـا. يتم إدخال ترميز جين المستضد ذي العلاقة إلى ناسخ فيروسات ألفا بحيث تستبدل الجينات التركيبية فيما تترك الجينات المكرّرة وغير التركيبية دون أن تمس. استخدم كل من فيروس سن دبس وفيروس غابة سيمليكي لبناء ناسخات فيروسات ألفا المعاد صياغتها وراثيا.

بعكس لقاحات الدنا التقليدية، فإن نواقل فيروسات ألفا تقتل الخلايا المَعْدَيَّة وتقدّم بشكل عابر فقط. كما أن جينات فيروسات ألفا المكررة يعبر عنها إضافة إلى إدخال اللقاح. ومع أنه ليس من الواضح الكيفية التي تثير فيها مكرِّرات فيروسات ألفا الاستجابة المناعية، إلا أنه يعتقد أن هذا قد يكون بسبب مستويات تعبير البروتين العالية من خلال هذا الناقل، تؤدي استجابات السايتوكين المستحث عن طريق المكرّر أو موت الخلايا المبرمج والمستَحَث عن طريق المكرر إلى امتصاص محسّن لمولد الضد عن طريق الخلايا التغصنيّة.