books standard methods and methods
If you do not find what you're looking for, you can use more accurate words.
الأساليب والطرق القياسية (Info)
التوليف الكيميائي للأليغنوكليوتيدات
المقال الرئيسي: توليف الأوليغنوكليوتيدات
الأوليغنوكليوتيدات يتم تصنيعها وتوليفها كيميائيا باستخدام نيوكليوتيدات تسمى فوسفوراميدايتس وهي عبارة عن نيوكليوتيدات عادية لديها مجموعات حماية: والتي من شأنها أن تمنع كلا من الأمينات ومجموعات الهيدروكسيل ومجموعات الفوسفات من أن تتفاعل بشكل غير صحيح. ويتم إضافة فوسفوراميدايت واحد في كل مرة، وبعد ذلك يتم نزع الحماية من الناتج "5- فوسفات" حيث يتم إضافة قاعدة جديدة وهكذا (إلى الوراء) وفي النهاية، يتم إزالة كافة مجموعات الحماية. ومع ذلك، أي بكونها عملية كيميائية، تحدث تفاعلات عديدة غير صحيحة مما يؤدي إلى تكون بعض النواتج المعيبة. وكلما طالت التتابعات الأوليغنوكليوتيدية التي يتم تخليقها، كلما ذادت العيوب فيها ولهذا فإن هذه العملية تعتبر مفيدة فقط لإنتاج تتابعات قصيرة من النيوكليوتيدات. ويتمثل الحد العملي الحالي في ما يقرب من (200) زوج من القواعد من الأوليغنوكليوتيدية ذات الكفاءة والجودة الكافية لكي تستخدم مباشرة في التطبيق الحيوي. ويمكن استخدام الكروماتوغرافيا السائلة عالية الآداء من أجل فصل المنتجات ذات التتابع المناسب والصحيح. وفي الوقت نفسه يمكن تخليق عدد كبير من الأليغونات بالتوازي مع الرقائق الجينية أو الوراثية. وللحصول على الآداء الأمثل لإجراءات التوليف الجيني المتلاحق، ينبغي أن يتم إعدادها كلا على حدة وبمقاييس أو معايير أكبر.
إتصال الأليغنوكليوتيدات القائم أو المستند على التلدين أو التخمير
عادة، هناك مجموعه من الأوليغنوكليوتيدات المصممة بشكل فردي يتم صناعتها على مولفات آلية ذات وسط صلب منقى ومتصل بواسطة عملية ربط قياسية أو تصلبات محددة أو تفاعلات بلمرة. ولتحسين تخصصية التخمر أو التصلب الأوليغنوكليوتيدي، تعتمد خطوة التخليق على مجموعه من إنزيمات البلمرة والربط للحمض النووي الثابتة حراريا. وحتى الآن، قد تم وصف عدة أساليب للتوليف الجيني مثل ربط الأوليغنوكليوتيدات المفسفرة المتداخلة , وطريقة فوك الأولى , والشكل المتحور من التفاعل التسلسلي الرابط للتخليق الجيني. بالإضافة إلى ذلك، تم وصف مناهج مجمعة لتفاعل البوليميريز المتسلسل. حيث عادة ما تستخدم الأوليغنوكليوتيدات ذات الطول (40 إلى 50) والتي تتداخل مع بعضها البعض. ويتم تصميم مثل تلك الأوليغنوكليوتيدات لتغطية معظم التتابعات على كلا الشريطين ويتم توليد الجزئ كامل الطول بالتتابع بامتداد التداخل "PCR(oE)", أو بالتوازن في الديناميكا الحرارية بين الداخل والخارج PCR(TBio) أو مفاهيم متحدة. وأكثر الجينات المخلقة شيوعا تتراوح في الحجم ما بين (600 إلى 1200) زوج من القواعد في حين أن الجينات الأكثر طولا قد تم تصنيعها عن طريق ربط أو وصل الجزيئات الجينية المجمعة مسبقا ذات الحجم الأقل من (1000) زوج من القواعد. وفي مثل هذا المدى الحجمي، يعتبر من الضروري اختبار استنساخات مرشحة عديدة تؤكد تتابع الجين الاصطناعي أو المخلق المستنسخ بطرق التتابع الآلية.
القيود أو المعوقات
علاوة على ذلك، لأن تجميع الناتج الجيني المكتمل الطول يعتمد على المحاذاة الفعالة والمحددة لشريط واحد طويل من الأوليغنوكليوتيدات، فإن هناك بارامترات أو وحدات قياسية حساسة وحاسمة لنجاح عملية التوليف تتمثل في أن مناطق التتابعات الممتدة تضم تراكيب ثانوية الناتجة عن التكرارات المعكوسة أو المحتوى المرتفع أو المنخفض الخارق للعادة من الجوانين والسيتوزين أو التركيبات المتكررة. وعادة، هذه القطع من الجين المعين يمكن فقط أن يتم تصنيعا عن طريق تقسيم الخطوات إلى عدة خطوات متتالية والتجميع النهائي لتتابعات أكثر قصرا مما يؤدي بدوره إلى زيادة كبيرة في الوقت والعمل أي الجهد اللازم لإنتاج هذا الجين. وتعتمد نتيجة تجربة التوليف الجيني بشدة على نوعية الأوليغنوكليوتيدات المستخدمة. ولمثل تلك البروتوكولات الخاصة بالتوليف الجيني المبني على التخمير أو التصلب، فإن كفاءة المنتج تعتمد بشكل مباشر ومضاعف على صحة الأوليغنوكليوتيدات المستخدمة. فبدلا من ذلك، بعد إجراء التوليف الجيني باستخدام أوليغونات أقل في الجودة، فإنه يجب بذل المزيد من الجهود لضمان الجودة أثناء التحليل الاستنساخي والذي يتم عادة بواسطة الاستنساخ القياسي المستهلك للوقت وبالإجراءات المتسلسلة. وهناك مشكلة أخرى مرتبطة بكل الطرق والأساليب الحالية للتوليف الجيني وهي التردد العالي من الأخطاء المتتابعة وذلك بسبب استخدام أوليغنوكليوتيدات مصنعه كيميائيا. حيث يزداد تواتر الخطأ في الأوليغوكليوتيدات الأطول وبالتالي يقل بشكل هائل نسبة النواتج الصحيحة بزيادة استخدام المزيد من الأوليغنوكليوتيدات. يمكن حل مشكلة الطفرات باستخدام عدد أقل أو سلسلة أقصر من الأوليغنوكليوتيدات من أجل تجميع الجين. وعلى الرغم من ذلك، كل طرق التجميع المبنية أو المعتمدة على التخمير أو التصلب تتطلب خلط البادئات الجينية مع بعضها البعض في أنبوبة واحدة. وفي هذه الحالة، فإن التداخلات الأقصر لا تسمح دائما بالتخمير أو التصلب الدقيق والمحدد للبادئات التكميلية مما يؤدي إلى إعاقة تكوين المنتج الكامل الطول. ويعتبر التصميم اليدوي للأوليغنوكليوتيدات إجراء شاق كما أنه لا يضمن التوليف أو التخليق الناجح للجين المرغوب فيه. وللحصول على الآداء الأمثل لكل الطرق المعتمدة على التصلب أو التخمير تقريبا، يفترض أن تكون درجات حرارة الذوبان للمناطق المتداخلة مماثلة لكل الأوليغنوكليوتيدات. ويجب تنفيذ أمثلية التمهيد الضرورية باستخدام برامج تصميم متخصصة للأوليغنوكليوتيدات. وقد تم تقديم وعرض عدة حلول لتصميم الدليل التمهيدي الآلي للتوليف الجيني حتى الآن.
إجراءات تصحيح الخطأ
للتغلب على المشاكل المرتبطة بنوعية وجودة الأوليغنوكليوتيدات، تم وضع وتطوير عدة إستراتيجيات فعالة لتوظف إما الأوليغنوكليوتيدات المحضرة كلا على حدة، أو إنزيمات الترابط الغير متوافقة لعائلة متس، أو إنزيمات الإندونيكليز المحددة من البكتريا أو العاثيات الفيروسية. ومع ذلك، فإن جميع هذه الإستراتيجيات تزيد من وقت وتكاليف التوليف الجيني المعتمد على تخمير وتصلب الأوليغنوكليوتيدات المصنعة كيميائيا. وزيادة على ذلك، يتم ترتيب الجينات في مجموعات بما في ذلك الجينات الوظيفية ذات الصلة أو المتغيرات المتعددة التسلسل على الجين الواحد. وتقريباً جميع البروتينات العلاجية الجاري تنميتها وتطوريها مثل الأجسام المضادة قد تم ضبطها عن طريق اختبار متغيرات جينية عديدة للآداء أو التعبير المحسن.
