books conventional chromatin immunoprecipitation
If you do not find what you're looking for, you can use more accurate words.
الترسيب المناعي التقليدي للكروماتين (Info)
هناك نوعان أساسيان للترسيب المناعي للكروماتين ChIP يختلفان بشكل أساسي في البدء بتحضير الكروماتين:
- الترسيب المناعي للكروماتين المتصالب (XChIP).
- الترسيب المناعي للكروماتين الفطري (NChIP).
الترسيب المناعي للكروماتين المتصالب (XChIP)
مناسبة لتحديد خريطة DNA عوامل الانتساخ وغيرها من البروتينات المرتبطة بالكروماتين.
- تعتمد هذه الطريقة على استخدام الكروماتين المتصالب القابل للعكس كمادة للبدء حيث يمكن استخدام أشعة الـأشعة فوق البنفسجية أو الفورم الدهيد كعامل لعكس الارتباط المتصالب.
- بعدها يُجزأ الكروماتين المتصالب عادة بالصَوْتَنَة لنحصل على شدف بطول 300- 1000 bp.
- تتم تجزأة الكروماتين باستخدام الفورم الدهيد اللطيف متبوعا بالهضم بواسطة النكلياز إذ أن شدف الكروماتين ذات 400-500 bpتعتبر مناسبة للمقايسة في طريقة الترسيب المناعي للكروماتين كونها تغطي اثنين أو ثلاثة نكليوزومات.
- يثفل حطام الخلايا في الحلالة المجزأة ويتم ترسيب معقد بروتين –DNA مناعيا بشكل انتقائي باستخدام أضاد نوعية للبروتين/ات الهدف وعادة ما يتم ربط هذه الاضداد مع الأغاروز أو السيفاروز أو خرزات مغناطيسية.
- تُجمع معقدات الترسيب المناعي (معقد خرزة- ضد -بروتين- تسلسل الـ DNA الهدف) وتُغسل للتخلص من الكروماتين المرتبط غير النوعي.
- يتم عكس الارتباط المتصالب بين الـDNA والبروتين والتخلص من البروتينات من خلال الهضم بالبروتياز K .
يمكن استخدام المحدد المستضدي الموسوم للبروتين الهدف أو استخدام الاضداد الموسومة بالبيوتين دخل الخلية بدلا من الأضداد للبروتين الفطري الهدف.
- تتم تنقية الـDNA والتعرف عليه بواسطة الـPCR أو microarrays (ChIP-on-chip) أو التنسيل الجزيئي وتحديد تسلسل النكليوتيدات(ChIP-Seq).
الترسيب المناعي للكروماتين الفطري (NChIP)
مناسبة لتحديد موقع الهيستوناتالتي تقوم بالتعديل على الـDNA الهدف.
- عادة يستخدم الكروماتين الفطري ككروماتين للبدء.
- وبما أنو الهيستونات تحيط حول الـDNA كي تشكل النكليوزوم فهي مرتبطة مع الـDNA بشكل طبيعي.
- بعدها يُجزأ الكروماتين بالهضم بواسطة النكلياز الميكروية التي تقطع الـDNA عند طول الرابط تاركة النكليوزومات سليمة ومعطية شدف من الـDNA تحوي من نكليوزوم واحد (200bp) إلى خمسة نكليوزومات (1000bp) بالطول.
- بعدها تُستعمل طرق مشابهة للـXChIP للتخلص من حطام الخلية وترسيب البروتين الهدف وازالة البروتين من معقد الترسيب المناعي وتنقية وتحليل معقد الـDNA المطلوب.
مقارنة بين XChIP وNChIP
الفائدة الأساسية للـNChIPهي في نوعية الضد إذ انه من الضروري ملاحظة أن أغلب أضداد الهيستونات المعدلة متفوقة على المستضدات الصنعية الببتيدية غير الثابتة. كما أن المحدد المستضدي المستعمل في الـXChIP للتمييز قد يتعطل أو يتحطم بارتباط التصالبي مع الفورم ألدهيد. و ان الارتباط التصالبي يتضمن حل المجموعة الامينية على النهايات N مما يسبب تعطيل المحدد المستضدي وهذا يسفر قلة فعالية بروتوكول الـXChIP مقارنة مع الـNChIP. لكن كلا الطريقتين تملك أهدافا وفوائد مختلفة مقارنة ببعضهما فالـXChIP تستعمل لتحديد المواقع الهدف لعوامل الانتساخ وغيرها من البروتينات المرتبطة بالكروماتين بينما الـNChIP تستعمل لتحديد المواقع الهدف للهيستونات المعدلة (انظر الجدول 1).
الجدول 1: فوائد ومساوئXChIP وNChIP
