كتب أنواع المثبتات الكيميائية

المثبتات التشابكية - ألدهيدات

تعمل المثبتات التشابكية من خلال خلق الروابط الكيميائية التساهمية بين البروتينات في النسيج. وهذا يثبت البروتينات القابلة للذوبان بالهيكل الخلوي، ويضفي صلابة إضافية على الأنسجة.

وإلى حد بعيد فإن المثبت الأكثر شيوعًا في الاستخدام في الأنسجة هو الفورمالديهايد. وعادة ما يُستخدم كفورمالين محمي محايد 10% أي حوالي الفورمالديهايد ما بين 3.7% و4% في دارئ الفوسفات الملحي. ونظرًا لأن الفورمالديهايد هو غاز في درجة حرارة الغرفة، يتحلل غاز فورمالين-الفورمالديهايد في الماء (~37% w/v) - يُستخدم عند إجراء مثبت سابق. بارافورمالدهيد هو شكل مبلمر من الفورمالديهايد، ، يتم الحصول عليه عادة على شكل مسحوق أبيض دقيق، الذي يزيل البلمرة ويعود إلى الفورمالين عند تسخينه. يقوم الفورمالديهايد بتثبيت الأنسجة بواسطة تشبيك البروتينات، وفي المقام الأول بقايا الحمض الأميني الأساسي ليزين. وآثاره قابلة للرد عن طريق الماء الزائد وهو يتجنب تصبغ الفورمالين. ومن بين الفوائد الأخرى: التخزين طويل المدى والاختراق الجيد للأنسجة. وهو جيد على نحو خاص لتقنيات الكيمياء الهيستولوجية المناعية. ويمكن أيضًا أن يُستخدم بخار الفورمالديهايد كمثبتات للطخات الخلية.

وهناك ألدهيد شائع آخر لعملية التثبيت وهو غلوتارالدهيد. وهو يعمل بطريقة مماثلة للفورمالديهايد من خلال التسبب في تشوه هياكل ألفا-الحلزوني في البروتينات. ومع ذلك غلوتارالدهيد هو جزيء أكبر حجمًا، ولذلك فإن معدل انتشاره عبر الأغشية أبطأ من الفورمالديهايد. وبالتالي قد تتم إعاقة تثبيت غلوتارالدهيد على عينات الأنسجة الأكثر سمكًا، ولكن يمكن التغلب على هذه المشكلة عن طريق تقليل حجم عينة الأنسجة. وإحدى مزايا التثبيت بالغلوتارالدهيد هو أنه قد يتيح منتجًا أكثر صلابة أو أكثر ارتباطًا وطوله الأكبر ومجموعتي الألدهيد يتيحان له ’إيصال‘ وربط أزواج جزيئات البروتين الأبعد. وإنه يسبب تغيرات سريعة غير قابلة للإعادة ويقوم بعملية التثبيت على نحو سريع ومناسب تمامًا للمجهر الإلكتروني، ويقوم بعملية التثبيت عند 4^oC، ويعطي أفضل التفاصيل الهيولية والنووية العامة. ومع ذلك فإنه ليس مثاليًا لتلطيخ الكيمياء الهيستولوجية المناعية.

وبعض بروتوكولات التثبيت تدعو إلى الجمع بين الفورمالديهايد والغلوتارالدهيد بحيث تكمل قوة كل منهما الآخر.

وهذه المثبتات المتشابكة لا سيما الفورمالديهايد تميل للمحافظة على البنية الثانوية للبروتينات وربما تحمي كميات كبيرة من البنية الثالثة أيضًا.

المثبتات المرسبة - الكحولات

تعمل المثبتات المرسبة (أو المغيرة للطبيعة) من خلال تقليل قابلية ذوبان جزيئات البروتينات و(غالبًا) من خلال تعطيل التفاعلات الكارهة للماء التي تعطي الكثير من البروتينات بنيتها الثالثة. وعملية ترسيب وتجميع البروتينات هي عملية مختلفة بشكل كبير عن التشابك الذي يحدث مع مثبتات ألدهيد.

والمثبتات الترسبية الأكثر شيوعًا هي الإيثانول والميثانول. وتُستخدم عادة لتثبيت الأجزاء المجمدة واللطخات. ويُستخدم الأسيتون أيضًا وقد تبين أنه يعطي حماية هيستولوجية (الأنسجة) أفضل من الأجزاء المجمدة عند استخدامه في تقنية أسيتون ميثيل البنزوات الزيلين.(AMEX).

ونادرًا ما تُستخدم ممسخات البروتينات - الميثانول والإيثانول والأسيتون - وحدها كحواجز تثبيت ما لم تدرس الأحماض الأمينية.

حمض الخليك هو ممسخ يُستخدم أحيانًا جنبًا إلى جنب مع المثبتات الترسبية الأخرى. ومن المعروف أن الكحوليات -في حد ذاتها- تسبب انكماش وتصلب الأنسجة أثناء التثبيت في حين أن حمض الخليك وحده معروف بتسببه في انتفاخ الأنسجة؛ والجمع بين المركبين قد يؤدي إلى محافظة أفضل على مورفولوجيا الأنسجة.

العوامل المؤكسدة

يمكن للمثبتات المؤكسدة التفاعل مع سلاسل جانبية مختلفة للبروتينات والجزيئات الحيوية الأخرى، مما يتيح تشكيل تشابكات تعمل على استقرار بنية الأنسجة. ومع ذلك، تسبب هذه المثبتات تمسخًا واسع النطاق على الرغم من المحافظة على نقاء بنية الخلية وتُستخدم بشكل رئيس كمثبتات ثانوية.

رباعي أكسيد الأوزميوم يُستخدم في كثير من الأحيان كمثبت ثانوي عند تحضير العينات للمجهر الإلكتروني. (لا يتم استخدامه للفحص المجهري الضوئي حيث إنه يخترق الأجزاء السميكة للأنسجة بشكل ضعيف للغاية.)

يمكن استخدام ثاني كرومات البوتاسيوم وحامض الكروم وبرمنغنات البوتاسيوم في تحضيرات هيستولوجية معينة.

الزئبقيات

تتمتع الزئبقيات مثل B-5 ومثبت زنكر بآلية غير معروفة تزيد سطوع اللطخة وتعطي تفاصيل نووية ممتازة. وعلى الرغم من سرعتها، فإن الزئبقيات تخترق بشكل ضعيف وتسبب انكماش الأنسجة. وأفضل تطبيق لها هو تثبيت الأنسجة المكونة للدم والأنسجة الشبكية البطانية. لاحظ أيضًا أنه نظرًا لأنها تحتوي على زئبق يجب توخي الحذر عند التخلص منها.

البيكرات

تخترق البكرات الأنسجة بشكل جيد للتفاعل مع الهيستونات والبروتينات الأساسية لتكوين البكرات البلورية مع الأحماض الأمينية وترسيب جميع البروتينات. وهي تُعتبر مثبتًا جيدًا للأنسجة الضامة وتحفظ الجليكوجين بشكل جيد وتستخرج الدهون لإعطاء نتائج فائقة للفورمالديهايد في التلطيخ المناعي للهرمونات بيولوجية المنشأ وعديدة الببتيد. ومع ذلك، فإنها تسبب فقدان كثرة القعدات ما لم يتم غسل العينة جيدًا عقب التثبيت. من المساوئ لهذا النوع من المثبتات هي أنها لا تقوم بتثبيت الكرموسومات كما أنها تخترق النسيج بشكل بطيء وهذا يؤدي إلى انكماش النسيج ولكن تتم معالجة هذا النسيج بواسطة جلاسيل اسيتك اسد Glacial acetic acid

مثبت HOPE

يعطي تأثير حماية حمض هيبس-غلوتاميك المذيب العضوي الدارئ (HOPE) مورفولوجيا شبيهة بالفورمالين ومحافظة ممتازة على المستضدات البروتينية المناعية للكيمياء الهيستولوجية المناعية والكيمياء النسيجية للإنزيمات ونتائج جيدة للحمض النووي (RNA) والحمض الريبي النووي المنزوع الأكسجين (DNA) وعدم وجود البروتينات المتشابكة.