كتب introductory steps

الاستخلاص

يجب وضع البروتين في محلول عن طريق تحطيم النسيج أو الخلايا الحاوية له، اعتماداً على مصدره. هناك عدة طرق لتحقيق ذلك: التجميد والتذويب المتكرر والصوتنة والمجانسة عن طريق الضغط العالي والترشيح وجعله نفوذا عن طريق المذيبات العضوية. تعتمد الطريقة المختارة على هشاشة البروتين ومدى تجلّد الخلايا. عادة وفي معظم الطرق المتعارف عليها، تستخدم كروماتوغرافيا العمود لتحقيق التنقية. بعد عملية الاستخلاص هذه تصبح البروتينات الذوابة في المذيب، ويمكن فصلها عن الغشاء الخلوي و دي إن أي إلخ. عن طريق الطرد المركزي. عملية الاستخلاص تستخلص أيضاً الببتيداز، والذي يبدأ بهضم البروتين في المحلول. عادة إن كان البروتين حساس للتحلل البروتيني، فمن المفضل العمل بسرعة وإبقاء المستخلص بارداً، لإبطاء التحلل البروتيني.

الترسيب والإذابة التفاضلية

يعتبر الترسيب باستخدام سلفات الأمونيوم خطوة أولى شائعة عند تنقية البروتين بكميات كبيرة. ويتم ذلك عن طريق إضافة كميات متزايدة من سلفات الأمونيوم وجمع الأجزاء المختلفة من البروتين المترسب. يمكن إزالة سلفات الأمونيوم فارز دياليز. تتعرض المجموعات الكارهة للماء من البروتينات إلى الجو وتجذب غيرها من البروتينات الكارهة للماء وتتجمع. البروتينات المترسبة ستكون كبيرة بما يكفي لرؤيتها. أحد مزايا هذه الطريقة هي إمكانية تنفيذها بكلف منخفضة على كميات كبيرة جداً.

أول البروتينات التي تذوب هي البروتينات الذوابة بالماء. تتطلب تنقية البروتين الغشائي تمزيق الغشاء الخلوي بهدف عزل بروتين محدد عن البقية الموجودة في نفس الحيز الغشائي. يمكن أحياناً عزل جزء غشائي محدد أولاً، مثل عزل الميتوكندريون عن الخلية قبل تنقية البروتين الموجود في غشاء الميتوكندريون. يمكن استخدام دوديسيل كبريتات صوديوم (SDS) كمنظف لإذابة الغشاء الخلوي والمحافظة على بروتينات الغشاء في المحلول أثناء التنقية؛ ولكن بالإمكان استخدام منظفات ألطف مثل Triton X-100 أو CHAPS للمحافظة على تكوين البروتين الأصلي خلال عملية التنقية، حيث أن SDS يسبب إفساد البروتين.

الطرد المركزي الفائق

تستخدم عملية الطرد المركزي قوة الطرد المركزي لفصل مزيج من جسيمات معلقة في سائل وذات كتل أو كثافات مختلفة. عندما يدور وعاء (عادة أنبوب أو قنينة) يحوي مزيج من البروتين أو أي مادة جسيمية أخرى، كالخلايا البكتيرية، بسرعات عالية، تولد عطالة كل جسيم قوة متناسبة مع كتلتها. نزعة جسيم ما إلى الحركة في السائل بسبب هذه القوة يقابلها المقاومة التي يبديها السائل على الجسيم.

الأثر النهائي "لتدوير" العينة في طارد مركزي هو أن الجسيمات الثقيلة والصغيرة ذات الكثافة العالية تتحرك نحو الخارج بشكل أسرع من الجسيمات الأقل ثقلاً أو من الجشيمات التي "تحتك" مع السائل بشكل أكبر. عندما يدوّر معلّق من الجسيمات في طارد مركزي، قم يتشكل "حزام" في أسفل الوعاء غني بالجسيمات الأثقل والأقل احتكاكاً مع السائل.

تبقى الجسيمات التي لم تتجمع في السائل الطافي ويمكن إزالته من الوعاء وبذلك يفصل الحزام عن المادة الطافية. تعتمد درجة الطرد المركزي على التسارع الزاوي المطبق على العينة، والذي يقاس عادة بالقوة g. إذا تم تطبيق الطرد المركزي لفترة كافية، ستصل الجسيمات في الوعاء إلى توازن والتي تتراكم فيها الجسيمات في نقطة من الوعاء حيث تتوازن عندها كثافة الطفو مع قوة الطرد المركزي. يسمح هذا التوازن في الطرد المركزي بالتنقية المطولة للجسيم ما.

في الطرد المركزي باستخدام وسط سكروز متدرج — يتم توليد وسط متدرج من السكروز (عادة السكروز أو الغليسيرول أو وسط متدرج في الكثافة مثل بيركول) في أنبوب بحيث تصبح التركيز الأعلى في أسفله والأدنى في أعلاه. بيركول هي علامة مسجلة مملوكة من شركات GE للعناية بالصحة. بعدها توضع طبقة من عينة البروتين في أعلى الوسط المتدرج وتدور على سرعات عالية عن طريق طرد مركزي فائق. يؤدي هذا إلى هجرة الجزيئات الثقيلة إلى أسفل الأنبوب بشكل أسرع من المواد الخفيفة. خلال الطرد المركزي دون استخدام وسط سكروز متدرج، تتعرض الجسيمات لقوة أكبر كلما بعدة أكثر عن مركز الدوران، بسبب تعرضها لقوة طرد مركزي أكبر (كلما ابتعدت، لكما تحركت أسرع). المشكلة في ذلك أنه يضيق مجال الفصل المفيد إلى مجال مرئي صغير. تدوير العينة ضعف المدة لا يعني أن الجسيمات المطلوبة ستبتعد إلى ضعف المسافة، بل ستبتعد أكثر بكثير. أما عند استخدام وسط متدرج من السكروز، فستواجه سائل متزايد الكثافة واللزوجة. سيعاكس وسط سكروز مصمم جيداً أثر تزايد قوة الطرد المركزي، بحيث تتحرك الجسيمات بشكل متناسب مع الزمن الذي تمضيه في الطرد المركزي. بعد فصل جسيمات البروتين، يجزأ الوسط ويجمع.