كتب experimental techniques

استخلاص الدهنيات

معظم طرق استخراج الدهنيات وعزلها من العينات البيولوجية باستغلال قابلية الذوبان العالية للسلاسل الهيدروكربونية في المحاليل العضوية. نظرا للتنوع في الفئات الدهنية، فمن غير الممكن احتواء كافة الفئات بطريقة استخلاص مشتركة. الإجراء التقليدي بليغ/ داير يستخدم كلوروفورم / بروتوكولات الميثانول الأساسية والتي تشمل فترة التجزئة في داخل الطبقة العضوية. هذه البروتوكولات تعمل بشكل جيد نسبيا لمجموعة متنوعة من الدهنيات المتصلة من الناحية الفيزيولوجية كذلك يتعين ملائمتها لكيمياء الدهنيات المعقدة ومنخفضة الوفرة والمستقلبات الدهنية اللامستقرة عندما كان يتم استخدام التربة العضوية فان السيترات العازلة من استخلاص المزيج أعطت كميات أكبر من الدهنيات الفوسفاتية أكثر الاستات العازلة، تريس أو H2O أو الفوسفات العازلة

فصل الدهنيات

أبسط طريقة للفصل الدهنيات هو استخدام طبقة استشراب رقيقة (تي ال سي) وإن لم تكن حساسة مثل غيرها من أساليب اكتشاف الدهنيات، فإنها توفر وسيلة فحص سريعة وشاملة لتقنيات سابقة أكثر حساسية وتعقيدا. استخلاص خلاصة المرحلة الصلبة ((اس بي اي)) مفيد للانفصال التحضيري السريع للمخاليط الدهنية الخام إلى طبقات دهنية مختلفة. وهذا ينطوي على استخدام الأعمدة المجمدة التي تحتوي على السيليكا أو مراحل ثابتة أخرى لفصل الغليسيروفوسفوليبيدز والأحماض الدهنية واستيرات الكوليسترول، والغليسيروليبيدز، والستيرولات من مخاليط الدهن الخام، ويستخدم الاستشراب السائل ذو الأداء العالي على نطاق واسع (الاستشراب السائل عالي الأداء أو LC) في تحليل اللبيديات لفصل الدهون قبل التحليل الشامل. ويمكن انجاز الفصل إما عن طريق مرحلة طبيعية منHPLC)الاستشراب السائل عالي الأداء(أو عكس مرحلة HPLC). على سبيل المثال، المرحلة الطبيعية HPLC تفصل على نحو فعال الغليسيروفوسفوليبيدز على أساس رأس مجموعة الاستقطاب، في حين عكس المرحلة HPLC فعالة بفصل الأحماض الدهنية مثل ايكوسانويدز على أساس طول السلسلة، ودرجة التشبع والاستبدال. HPLC من الدهون إما أن يتم تنفيذها حاليا أو عبر الإنترنت حيث يتم إدماج شطافة مع مصدر التأين لمطيافية الكتلة.

اكتشاف الدهون

وقد تسارع التقدم في علم الدهنيات الحديث بشكل كبير من خلال تطوير أساليب التحليل الطيفي عموما وتقنيات التأيين اللين لقياس الطيف الكتلي مثل التأين بالرش الكهربائي (اي اس آي) ) والنسيج الغشائي الذي يتلقى مساعدة بنضح الليزر (MALDI) على وجه الخصوص. التأين " اللين" لا يسبب تجزئة واسعة النطاق، حتى يتسنى لها اكتشاف شامل لمجموعة بأكملها من الدهون داخل خليط معقد ويمكن ان تعزى للظروف التجريبية أو حالة المرض. وبالإضافة إلى اي اس آي و MALDI فان تقنية تأين الضغط الجوي الكيميائية (APCI) أصبحت تحظى بشعبية متزايدة لتحليل الدهون غير القطبية

اي اس آي-مطيافية الكتلة

اي اس آي- مطيافية الكتلة تطورت مبدئيا بواسطة فين وزملاؤه لتحليل الجزيئات الحيوية. وتعتمد على تشكيل الأيونات الغازية من القطبية وقابليتها للتغيير حراريا ومعظم هذه الجزيئات من الجزيئات غير المتطايرة، وبالتالي فهي مناسبة كليا لمجموعة متنوعة من الدهون. وهذه هي طريقة التأين اللينة التي نادرا ما تعرقل الطبيعة الكيميائية للعينة المراد تحليلها قبل تحليل الكتلة. وقد تم تطوير العديد من أساليب اي اس آي- مطيافية الكتلة لتحليل مختلف الطبقات والفئات الفرعية وأنواع الدهون الفردية من مستخلصات بيولوجية. وقد تم في الآونة الأخيرة نشر مراجعة شاملة لهذه الأساليب وتطبيقاتها. وتشمل المزايا الرئيسية ل اي اس آي-مطيافية الكتلة من مثل الدقة العالية والحساسية وإعادة الإنتاج وتطبيق تقنية لإيجاد حلول معقدة دون الرجوع للاشتقاق المسبق. هان وزملاء ه طوروا طريقة تعرف باسم " بندقية علم الدهنيات " والتي تنطوي على حقن مباشر من الدهون الخام المستخرجة إلى مصدر اي اس آي الأمثل لفصل الدهون داخل المصدر استنادا إلى خصائصها الكهربائية الجوهرية.

MALDI-مطيافية الكتلة

مطياف الكتلة MALDI هو طريقة التأين اللينة المعتمدة على الليزر وكثيرا ما تستخدم لتحليل البروتينات الكبيرة، ولكنها كانت قد استخدمت بنجاح للدهون. ان الدهون مختلطة مع النسيج الغشائي، مثل 2،5 - حامض ديهيدروكسيلبينزوديك (حمض جيني) وتطبيقها على عينة حاملة بوصفها بقعة صغيرة. ويتم بهذه الطريقة أطلاق الليزر على بقعة ويقوم النسيج الغشائي بامتصاص الطاقة، والتي يتم نقلها بعد ذلك إلى المحلل، مما يؤدي لتأيين الجزيء MALDI فترة الهروب(حركة سريعة) (MALDI - TOF) أصبحت مطيافية الكتلة نهجا واعدا جدا لدراسات علم الجينات، لا سيما بالنسبة لتصوير الدهون من شرائح الأنسجة.

APCI-مطيافية الكتلة

ان مصدر APCI هو مماثل ل اي اس آي إلا أن الايونات تتشكل من تفاعل المذيبات الساخنة المراد تحليلها مع إبرة تفريغ الكورونا التي وضعت في جهد كهربائي عالي. يتم تشكيل الأيونات الأولية فورا في المناطق المحيطة بالإبرة، وهذا التفاعل مع المذيبات لتشكيل أيونات ثانوية يقوم يتأيين العينة في نهاية المطاف. APCI مفيد لا سيما لتحليل الدهون غير القطبية مثل ترياسيغليسيرولز والستيرول واسترات الأحماض الدهنية.