كتب crispr in prokaryotes

كريسبر-كاس كآلية دفاع

وُجد أن تسلسلات كريسبر هي وسيلة مناعية تكيفية تستخدمها بدائيات النوى كالبكتيريا ضد العناصر الجينية الدخيلة (مثل البلازميدات والفاجات) التي يتعرض لها الكائن بدائي النواة. فمثلا، عندما يصيب فيروس بكتيريوفاج بكتيريا فإنه يحقن حمضه النووي DNA داخل البكتيريا، ليتكاثر داخل البكتريا بأعداد كبيرة قد تقتلها. عندها تطلق البكتيريا أنزيمات لتقوم بجمع قطع من الحمض النووي لذلك لفيروس، ومن ثم تخزين تلك الشيفرة في كريسبر، عن طريق إضافة وحذف قطع من الحمض النووي الفاصل في منطقة كريسبر، الذي وُجد أنه يطابق أجزاء من الشيفرة الوراثية الخاصة بالفيروس. وبذلك، عند تعرض البكتيريا لفيروس مماثل مرة أخرى، تقوم البكتيريا بنسخ الحمض النووي المخزن في كريسبر على هيئة RNA، يسمى crRNA. يقترن crRNA ببروتين القطع cas9، حيث يستخدمه cas9 للتعرف على الفيروس. وعندما يلتقي إنزيم cas9 بفيروس، فإنه وبطريقة تبدو وكأنه يمتطي سلسلتي الـDNA الخاصة بالفيروس يبحث عن تطابق بين جزء من الـcrRNA الذي يحمله وبين الحمض النووي الخاص بالفيروس. هذا الجزء من crRNA الذي يستخدم في التعرف على الفيروس يكون طوله 20 نيوكلوتيد تقريبا. فإذا تطابقت الـ20 نيوكليوتايد التي يحملها cas9 مع 20 نيوكليوتايد من DNA الفيروس، تنفك سلسلتي الـDNA، ما يحفز cas9 لقطع سلسلتي DNA الخاصة بالفيروس، مسبباً تدميره.

تركيب منطقة كريسبر

تتكون منطقة كريسبر من تكرارات تسلسلات النيوكليوتيدات المتناظرة والمتباعدة بشكل منتظم، والتي يوجد بينها قطع صغيرة وفريدة من الحمض النووي الفاصل.

ويجدر الذكر أن هنالك عدة أنواع من أنظمة كريسبر تختلف باختلاف نوع البكتيريا، لذا فيمكن أن يختلف تركيب تسلسل كريسبر وأنزيماته وطريقة نسخ الـcrRNA من نوع لآخر.

تشتمل منطقة كريسبر على منطقة محفز promoter لضمان أن منطقة كريسبر يمكن قراءتها وترجمتها إلى CRISPR-RNA (أو crRNA) الذي تستخدمه الأنزيمات المتعلقة بكريسبر cas proteins في التعرف على الهدف.

يتبع المحفز تكرارات قصيرة short repeats بينها فواصل فريدة spacers:

فأمّا التكرارات repeats تكون موجودة في الحمض النووي البكتيري أصلاً، ويتم نسخها كالجزء الثابت من الـcrRNA. هي أجزاء أطول، عادة ما يتراوح طولها ما بين 28 إلى 37 زوجاً قاعدياً، لكن يمكن أن تكون أقصر أو أطول من ذلك. بعض تكرارات كريسبر تكون على هيئة تسلسلات متناظرة (بالإنجليزية: Palindromic sequences) أي أن كل سلسلة من سلسلتي الـDNA تحتوي تسلسل من النيوكليوتيدات بحيث أنه إذا كان ذلك التسلسل يُقرأ من النهاية 5" إلى 3" في إحدى السلسلتين فإنه يكون متطابقا تماما إذا قُرئ من النهاية 5" إلى 3" في السلسلة المكلمة واللتان تشكلان معا اللولب المزدوج للـDNA. هذا التسلسل المتناظر يعني أنه ينسخ RNA ذو ترابط قاعدي، فيكون شريط RNA مطوياً ذو شكل ثابت فعال، على شكل حلقة جذعية stem-loop تساعد في تعرف أنزيمات cas عليه. بينما تركبت بعض تكرارات كريسبر بحيث يكون RNA الناتج غير مطوي على شكل محدد.

وأمّا الفواصل spacers فهي الأجزاء التي تمت إضافتها من الحمض النووي الفيروسي المهاجِم، ويتم نسخها كالجزء المتغير من الـcrRNA الذي يتصل بالأنزيم cas9، وهو الذي يستخدم في التعرف على DNA المطابق. طولها كـDNA عادة ما يقع بين 32 و 38 زوجاً قاعدياً (لكنه يتراوح ما بين 21 إلى 72 زوج قاعدي). وقد تظهر فواصل جديدة خلال مدة قصيرة كجزء من الاستجابة المناعية للهجوم الفيروسي على البكتيريا.

وعادة ما يكون هنالك أقل من 50 وحدة من تسلسل "تكرار-فاصل" في منطقة كريسبر واحدة.

توجد جينات أخرى مجاورة لكريسبر معروفة باسم الجينات المتعلقة بكريسبر cas genes، والتي تحتوي على الشيفرة اللازمة لبناء البروتينات المتعلقة بكريسبر cas proteins - والتي من ضمنها أنزيم cas9. يتبع تسلسل CRISPR والفواصل منطقة لبناء جزيء RNA يعرف باسم tracrRNA، والذي يرشد جزيئات القطع وcrRNA إلى مواقعها المستهدفة على DNA.

أي أنه، في الطبيعة، يتكون RNA الكلي الذي يتصل بأنزيم cas9 من هذين الجزأين: الجزء الثابت الذي لا يتغير بتغير الهدف، بحسب بعض المصادر يسمى tracrRNA، (وبعضها الآخر يعتبره جزءاً من crRNA) وله دور آخر في البكتيريا في تكوين الجزء المتغير والمشابه لحمض الفيروس النووي، والذي يسمى crRNA، وهذا الثاني يستخدمه الأنزيم في التعرف على الهدف ويتكون من 20 نيوكليوتيد تقريباً. عادة ما يكوّنان الجزء الثابت والجزء المتغير معاً guide RNA الدليل أو gRNA اختصارا، وهذه التسمية (gRNA) عادة ما تطلق على RNA المصنع لا البكتيري الذي يطلق عليه فقط crRNA.