كتب basics of interaction

يُضخم تفاعل البوليميراز المتسلسل مناطق محددة من شريط الدنا (الدنا الهدف). تضخم معظم طرائق تفاعل البوليميراز المتسلسل شظايا الدنا التي يتراوح طولها بين 0.1 و10 كيلو زوج قاعدي (kbp)، رغم أن بعض التقنيات تسمح بتضخيم للشظايا يصل إلى 40. تُحدد كمية الناتج المُضخم بواسطة الركائز المتاحة في التفاعل، التي تصبح محدودة مع تقدم التفاعل.

يتطلب إعداد تفاعل البوليميراز المتسلسل العديد من العناصر والكواشف، بما فيها:

• قالب دنا يحتوي على الدنا المُستهدف المراد تضخيمه
• بوليميراز الدنا، وهو إنزيم يبلمر شرائط الدنا الجديدة؛ يشيع استخدام بوليميراز المستحرة المائية المقاوم للحرارة أيضًا، لأنه يبقى سليمًا في الغالب خلال عملية تمسخ الدنا عالية الحرارة.
• اثنان من مشرعات الدنا التي تُعتبر نيكليوتيدات مكملة للنهاية 3" (ثلاثة مشرعات) لكل من المناطق الحساسة وغير الحساسة للدنا الهدف (يمكن لبوليميراز الدنا فقط أن يرتبط بمنطقة ثنائية الشريط من الدنا ويتطاول منها، ودون المشرعات لن تكون هناك منطقة ثنائية الشريط من الدنا ليرتبط بها البوليميراز)؛ تُختار المشرعات المحددة المكملة للمنطقة الهدف من الدنا مسبقًا، وغالبًا ما تُصنع بشكل مخصص في المختبر أو تُشترى من موردي المواد الكيميائية الحيوية التجاريين.
• نيوكليوسيدات منقوصة الأكسجين ثلاثية الفوسفات، أو dNTPs (تُسمى أحيانًا «نيوكليوتيدات منقوصة الأكسجين ثلاثية الفوسفات»؛ هي نيوكليوتيدات تحتوي على مجموعة ثلاثي الفوسفات)، وهي الدعائم الأساسية التي يصنع منها بوليميراز الدنا شريطَ دنا جديدًا.
• محلول منظم يوفر بيئة كيميائية مناسبة لتحقيق النشاط والثبوتية الأمثلَين لبوليميراز الدنا.
• كاتيونات ثنائية التكافؤ، عادةً ما تكون أيونات المغنسيوم (Mg²⁺) أو المنغنيز (Mn²⁺)؛ المغنسيوم ثنائي التكافؤ هو الأكثر شيوعًا، ولكن يُستخدم المنغنيز في تطفر الدنا المتواسط بتفاعل البوليميراز المتسلسل، إذ إن تركيز المنغنيز الزائد يرفع معدل الخطأ في أثناء تصنيع الدنا. بالإضافة إلى الكاتيونات أحادية التكافؤ مثل أيونات البوتاسيوم (K).

يُجرى التفاعل عادةً بحجم 10-200 ميكرولتر في أنابيب تفاعل صغيرة (0.2-0.5 مليلتر) في جهاز تدوير حراري. يسخّن جهاز التدوير الحراري أنابيب التفاعل ويبردها لتحقيق درجات الحرارة المطلوبة في كل خطوة من خطوات التفاعل (انظر أدناه). تستخدم العديد من أجهزة التدوير الحرارية الحديثة التبريد الكهروحراري الذي يتيح تسخين الكتلة الحاملة لأنابيب تفاعل البوليمراز المتسلسل وتبريدها ببساطة من خلال عكس التيار الكهربائي. تسمح أنابيب التفاعل ذات الجدران الرقيقة بالتوصيل الحراري المناسب للسماح بالموازنة الحرارية السريعة. تحتوي معظم أجهزة التدوير الحرارية على أغطية ساخنة لمنع التكثف في الجزء العلوي من أنبوب التفاعل. تتطلب أجهزة التدوير الحرارية القديمة التي تفتقر إلى غطاء ساخن طبقةً من الزيت فوق خليط التفاعل أو كرة من الشمع داخل الأنبوب.

الإجراء

يتكون تفاعل البوليميراز المتسلسل عادةً من 20-40 تغير متكرر في درجة الحرارة، وتُسمى هذه التغيرات الدورات الحرارية، وتتكون كل دورة عادةً من قياسين أو ثلاثة قياسات منفصلة لدرجات الحرارة (انظر الشكل أدناه). غالبًا ما يسبق الدورة خطوة درجة حرارة واحدة عند درجة حرارة عالية جدًا (> 90 درجة مئوية (194 درجة فهرنهايت)) ويتبعها انتظار واحد في النهاية لتمديد المنتج النهائي أو التخزين القصير. تعتمد درجات الحرارة المستخدمة وطول مدة تطبيقها في كل دورة على مجموعة متنوعة من الثوابت، بما في ذلك الإنزيم المستخدم في تخليق الدنا، وتركيز الأيونات ثنائية التكافؤ وdNTPs في التفاعل، ودرجة حرارة انصهار (Tm) المشرعات. الخطوات الشائعة لمعظم طرق تفاعل البوليميراز المتسلسل هي على النحو الآتي:

• التهيئة: هذه الخطوة مطلوبة فقط لبوليميرازات الدنا التي تتطلب التنشيط الحراري عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل البادئ الساخن. وتتكون من تسخين حجرة التفاعل إلى درجة حرارة 94-96 درجة مئوية (201-205 درجة فهرنهايت)، أو 98 درجة مئوية (208 درجة فهرنهايت) إن استُخدمت مشرعات عالية الحرارة، والتي يُحتفظ بها بعد ذلك لمدة 1-10 دقائق.
• الإفساد: هذه الخطوة هي أول حدث تدوير منتظم، وتتكون من تسخين حجرة التفاعل إلى 94-98 درجة مئوية (201-208 درجة فهرنهايت) لمدة 20-30 ثانية. يؤدي هذا إلى ذوبان قالب الدنا ثنائي الشريط، أو إفساده، عن طريق كسر روابط الهيدروجين بين الأسس المكملة، ما يُنتج جزيئَي دنا أحادي الشريط.
• التصلب: في الخطوة التالية، تنخفض درجة حرارة التفاعل إلى 50–65 درجة مئوية (122-149 درجة فهرنهايت) لمدة 20-40 ثانية، ما يسمح بتصليب المشرعات لكل من قوالب الدنا أحادي الشريط. يتضمن خليط التفاعل عادةً اثنين من المشرعات: واحد لكل من المكملات أحادية الشريط التي تحتوي على المنطقة الهدف. المشرعات هي تسلسلات أحادية الشريط بحد ذاتها ولكنها أقصر بكثير من المنطقة الهدف، تكمل بذلك تسلسلات قصيرة جدًا في النهاية 3" لكل شريط.

من الضروري تحديد درجة حرارة ملائمة لمرحلة التصليب لأن الكفاءة والخصوصية تتأثران بشدة بدرجة حرارة التصليب. يجب أن تكون درجة الحرارة هذه منخفضة بما يكفي لتسمح بتهجين المشرع إلى الشريط، وعالية بما يكفي ليكون هذا التهجين محددًا، أي يجب أن يرتبط المشرع بجزء محدد مكمل من الشريط لا في أي مكان آخر. إن لم تكن درجة الحرارة كافية، فإن المشرع سيرتبط بصورة شاذة. وإن كانت مرتفعة جدًا، فقد لا يرتبط المشرع أساسًا. درجة الحرارة المثلى للتصليب هي 3-5 درجة مئوية وهي أقل من درجة حرارة المشرعات المستخدمة. لا تتكوّن روابط الهيدروجين المستقرة بين الأسس المكملة إلا عندما يكون تسلسل المشرعات متطابقًا مع تسلسل القالب. خلال هذه الخطوة، يرتبط البوليميراز بقالب المشرع الهجين ويبدأ تشكيل الدنا.

• التمديد/الإطالة: تعتمد درجة الحرارة في هذه الخطوة على بوليميراز الدنا المستخدم؛ درجة حرارة النشاط المثلى لبوليميراز الدنا المستقر حراريًا لبوليميراز المستحرة المائية هي 75-80 درجة مئوية (167-176 درجة فهرنهايت) تقريبًا، مع أن درجة الحرارة التي يشيع استخدامها مع هذا الإنزيم هي 72 درجة مئوية (162 درجة فهرنهايت). في هذه الخطوة، يصنّع بوليميراز الدنا شريط دنا جديدًا مكملًا لقالب شريط الدنا عن طريق إضافة dNTPs حرة من خليط التفاعل المكمّل للقالب في الاتجاه من 5" إلى 3"، ما يكثف مجموعة 5"-فوسفات من dNTPs مع مجموعة 3"-هيدروكسيل الدنا الناتج (الممدد). يعتمد الوقت الدقيق المطلوب للتمديد على بوليميراز الدنا المستخدم وعلى طول منطقة الدنا الهدف المراد تضخيمها. كقاعدة عامة، عند درجة الحرارة المثلى، فإن معظم بوليميراز الدنا يبلمر ألف أساس نيوكليوتيدي في الدقيقة. في ظل الظروف المثلى (على سبيل المثال، إذا لم تكن هناك قيود متعلقة بنقص الركائز أو الكواشف)، يتضاعف عدد تسلسلات الدنا المستهدف في كل خطوة من التمديد/الإطالة. مع كل دورة ناجحة، تصبح أشرطة القالب الأصلية بالإضافة إلى جميع الأشرطة المنتجة حديثًا أشرطة قالب للدورة التالية من التمديد، ما يؤدي إلى تضخيم أسي (هندسي) لمنطقة الدنا المستهدف المحددة.
• تشكل عمليات الإفساد والتمديد والتصليب دورة واحدة. تحصل الدورات المتعددة عندما يستوجب تضخيم منطقة الدنا المستهدف إلى ملايين النسخ. الصيغة المستخدمة لحساب عدد نسخ الحمض النووي المتشكلة بعد عدد معين من الدورات هي 2ⁿ، حيث n هو عدد الدورات. ومن ثم فإن التفاعل الذي يحصل على 30 دورة ينتج عنه 2³⁰، أو 1073741824، نسخة من منطقة الدنا ثنائي الشريط المستهدف.
• الاستطالة النهائية: هذه الخطوة اختيارية، ولكنها تُنفذ عند درجة حرارة 70-74 درجة مئوية (158-165 درجة فهرنهايت) (نطاق درجة الحرارة المطلوب للنشاط الأمثل لمعظم البوليمرات المستخدمة في تفاعل البوليميراز المتسلسل) لمدة 5-15 دقيقة بعد دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل الأخيرة للتحقق من أن أي دنا أحادي الشريط متبقٍّ قد مُدد بالكامل.
• الانتظار الأخير: يتم من خلال الخطوة الأخيرة تبريد حجرة التفاعل إلى 4-15 درجة مئوية (39-59 درجة فهرنهايت) لفترة غير محددة، ويمكن استخدامها للتخزين قصير المدى لنواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل.

للتحقق مما إذا كان تفاعل البوليميراز المتسلسل قد نجح في إنشاء المنطقة المستهدفة المتوقعة من الدنا (التي يُشار إليها أحيانًا باسم المنطقة المُضخمة أو أمبليكون)، يمكن استخدامالرحلان الكهربائي باستخدام جيل الأغاروز لفصل نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل بناءً على حجمها. يُحدد حجم منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل من خلال المقارنة على دنا مدرج، مؤشر الوزن الجزيئي الذي يحتوي على شظايا دنا معروفة الحجم تُقاس على جيل الأغاروز إلى جانب نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل.

المراحل

كما هو الحال في التفاعلات الكيميائية الأخرى، يتأثر معدل تفاعل البوليميراز المتسلسل وكفاءته بعوامل محددة. بناء على ذلك، يمكن تقسيم عملية تفاعل البوليميراز المتسلسل بالكامل إلى ثلاث مراحل وذلك تبعًا تقدم التفاعل:

• التضخيم الأسي: تتضاعف كمية الناتج في كل دورة (على فرض أن كفاءة التفاعل 100%). بعد 30 دورة، يمكن مضاعفة النسخة الواحدة من الدنا حتى مليار نسخة. بمعنى ما، يجري التلاعب في تكرار شريط منفصل من الدنا في ظروف مخبرية خاضعة للسيطرة. الفاعل حساس للغاية، إذ يجب وجود كميات دقيقة جدًا من الدنا فقط.
• مرحلة الثبات: يتباطأ التفاعل مع تراجع نشاط البوليميراز واستهلاك الكواشف، مثل dNTPs والمشرعات، ما يجعلهما أكثر محدودية.
• الهضبة: لا يتراكم المزيد من النواتج بسبب استنفاد الكواشف والإنزيم.